ABSTRACT

Objective: To describe a murine model of emphysema induced by a combination of exposure to cigarette smoke (CS) and instillation of porcine pancreatic elastase (PPE). Methods: A total of 38 C57BL/6 mice were randomly divided into four groups: control (one intranasal instillation of 0.9% saline solution); PPE (two intranasal instillations of PPE); CS (CS exposure for 60 days); and CS + PPE (two intranasal instillations of PPE + CS exposure for 60 days). At the end of the experimental protocol, all animals were anesthetized and tracheostomized for calculation of respiratory mechanics parameters. Subsequently, all animals were euthanized and their lungs were removed for measurement of the mean linear intercept (Lm) and determination of the numbers of cells that were immunoreactive to macrophage (MAC)-2 antigen, matrix metalloproteinase (MMP)-12, and glycosylated 91-kDa glycoprotein (gp91phox) in the distal lung parenchyma and peribronchial region. Results: Although there were no differences among the four groups regarding the respiratory mechanics parameters assessed, there was an increase in the Lm in the CS + PPE group. The numbers of MAC-2-positive cells in the peribronchial region and distal lung parenchyma were higher in the CS + PPE group than in the other groups, as were the numbers of cells that were positive for MMP-12 and gp91phox, although only in the distal lung parenchyma. Conclusions: Our model of emphysema induced by a combination of PPE instillation and CS exposure results in a significant degree of parenchymal destruction in a shorter time frame than that employed in other models of CS-induced emphysema, reinforcing the importance of protease-antiprotease imbalance and oxidant-antioxidant imbalance in the pathogenesis of emphysema.

Keywords: Tobacco; Models, animal; Emphysema; Respiratory physiological phenomena; Lung injury.

RESUMO

Objetivo: Descrever um modelo murino de enfisema induzido por exposição a fumaça de cigarro (FC) e instilação de elastase pancreática porcina (EPP). Métodos: Trinta e oito camundongos C57BL/6 foram aleatoriamente divididos em quatro grupos: controle (uma instilação intranasal de solução salina a 0,9%); EPP (duas instilações intranasais de EPP); FC (exposição a FC durante 60 dias) e FC + EPP (duas instilações intranasais de EPP + exposição a FC durante 60 dias). No fim do protocolo experimental, todos os animais foram anestesiados e traqueostomizados para o cálculo de parâmetros de mecânica respiratória. Em seguida, todos os animais foram sacrificados e seus pulmões foram removidos para a medição da intercepção linear média (Lm) e a determinação do número de células imunorreativas a antígeno macrofágico (MAC)-2, metaloproteinase da matriz (MMP)-12 e glicoproteína glicosilada de 91 kDa (gp91phox) no parênquima pulmonar distal e na região peribrônquica. Resultados: Embora não tenha havido diferenças entre os quatro grupos quanto aos parâmetros de mecânica respiratória avaliados, houve aumento da Lm no grupo FC + EPP. O número de células positivas para MAC-2 na região peribrônquica e no parênquima pulmonar distal foi maior no grupo FC + EPP do que nos outros grupos, assim como o foi o número de células positivas para MMP-12 e gp91phox, porém somente no parênquima pulmonar distal. Conclusões: Nosso modelo de enfisema induzido por instilação de EPP e exposição a FC resulta em um grau significativo de destruição parenquimatosa em um período de tempo menor que o empregado em outros modelos de enfisema induzido por FC, o que reforça a importância do desequilíbrio entre proteases e antiproteases e entre oxidantes e antioxidantes na patogênese do enfisema.

Palavras-chave: Tabaco; Modelos animais; Enfisema; Fenômenos fisiológicos respiratórios; Lesão pulmonar.

INTRODUÇÃO

Modelos animais de enfisema têm sido amplamente usados para que se compreenda melhor a patogênese da doença. Isso ocorre em virtude do fato de que estudos com seres humanos concentram-se exclusivamente na análise morfológica e molecular de fragmentos de tecido pulmonar de pacientes submetidos a procedimentos cirúrgicos ou são estudos in vitro realizados em um único momento.

Os modelos de enfisema induzido por fumaça de cigarro (FC) ou elastase são os mais usados modelos murinos da doença, e ambos são capazes de produzir alterações patológicas semelhantes ao enfisema em seres humanos. No entanto, como nenhum dos dois modelos é capaz de simular minuciosamente a doença em seres humanos, é impor-tante compreender as vantagens e desvantagens de cada um.(1) Embora os modelos de enfisema induzido por FC aparentemente sejam os que representam melhor a patogênese do enfisema em seres humanos, uma grande limita-ção desses modelos é que, independentemente de quanto tempo os animais sejam expostos a FC, o aumento alveo-lar resultante é leve em comparação com o resultante de modelos animais de enfisema induzido por elastase.(1-3) Dependendo da dose, a instilação intratraqueal ou intranasal de elastase pode resultar em enfisema grave em pouco tempo,(1,4-7) além de resultar em aumento significativo do tamanho dos alvéolos, da quantidade de fibras de coláge-no e da quantidade de fibras elásticas, o que sugere um processo de remodelação do parênquima pulmonar.(4,6) No entanto, a principal desvantagem dos modelos de enfisema induzido por elastase é que eles não desencadeiam todos os eventos fisiológicos desencadeados pelos modelos de enfisema induzido por FC; portanto, sua relevância para abordagens terapêuticas é limitada.(1)

Modelos animais de enfisema induzido por FC e elastase têm sido usados não só para elucidar as alterações estru-turais do tecido pulmonar, mas também para esclarecer os mecanismos de desenvolvimento do enfisema. Embora a hipótese do desequilíbrio entre proteases e antiproteases ainda seja a mais amplamente aceita para explicar a des-truição parenquimatosa característica do enfisema,(8-11) o estresse oxidativo também deve ser levado em conta, já que a carga de oxidantes é maior em fumantes em resposta a compostos presentes na FC.(12,13) Na tentativa de redu-zir o tempo de exposição à fumaça necessário para induzir enfisema e simular da melhor maneira possível as carac-terísticas patológicas do enfisema em seres humanos, elaboramos um modelo experimental de enfisema induzido por instilação de elastase pancreática porcina (EPP) e exposição a FC durante apenas 2 meses.

MÉTODOS

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana e Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, na cidade de São Paulo (SP). Foram usados no estudo camundongos C57BL/6 machos de seis a oito semanas de idade e 20-25 g de peso. Todos os animais receberam tratamento humanitário em conformi-dade com o Guia de Tratamento e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health dos EUA (Publica-ção n. 85-23 do NIH, revisada em 1996).

Para a indução do enfisema, os animais foram anestesiados com xilazina e cetamina (i.m., 5 mg/kg e 40 mg/kg, respectivamente) e então submetidos a instilação intranasal de 50 µl de EPP tipo I (E1250; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), cuja dose foi menor (isto é, 0,33 UI) que a usada em outros modelos de enfisema induzido por EPP, já que nosso objetivo era induzir enfisema por meio de instilação de EPP e exposição a FC.(14) Os animais receberam um total de duas doses de EPP (uma dose no dia 0 e uma dose no dia 30). Os animais de controle receberam 50 µl de solução salina a 0,9% (veículo).

Para os animais expostos a FC, o protocolo começou no dia 1. Os animais foram expostos a FC em uma câmara de inalação de 28 l com duas entradas (uma para o ar e outra para a fumaça), uma saída e uma ventoinha para misturar melhor o ar e a fumaça dentro da câmara. Uma das entradas foi ajustada para fornecer fluxo de ar sintético a 2 l/min e a outra para fornecer fluxo de ar sintético proveniente de um sistema Venturi conectado a um cigarro aceso, aspi-rando a FC para dentro da câmara. Era possível alterar o fluxo de modo a aumentar ou diminuir a quantidade de fumaça na câmara. Após várias medições da concentração de CO na câmara, o fluxo foi ajustado para 1,5 l/min, o que resultou em uma concentração de CO de 250-350 ppm. Os níveis de carboxi-hemoglobina foram mantidos em 10 ± 1,3% em todos os camundongos expostos a FC. Os animais foram expostos à fumaça proveniente de 12 ± 1 cigar-ros comerciais com filtro (cada um contendo 0,8 mg de nicotina, 10 mg de alcatrão e 10 mg de CO), com concentra-ção total de material particulado = 411,4 ± 30 µg/m3 por dia. A duração da exposição foi de 60 min por dia (isto é, dois períodos de exposição de 30 min) 5 dias por semana durante 2 meses. Os camundongos de controle foram expostos ao ar ambiente.(15)

Trinta e oito camundongos C57BL/6 foram aleatoriamente divididos em quatro grupos (Figura 1): controle (n = 9), formado por camundongos que receberam uma instilação intranasal de solução salina a 0,9% no dia 0 e foram sacrificados no dia 60
EPP (n = 9), formado por camundongos que receberam duas instilações intranasais de EPP (uma no dia 0 e uma no dia 30) e foram sacrificados no dia 60 FC (n = 10), formado por camundongos expostos a FC duas vezes por dia 5 dias por semana durante 60 dias e sacrificados no dia 60 FC + EPP (n = 10), formado por camundongos que receberam duas instilações intranasais de EPP (uma no dia 0 e uma no dia 30), foram submetidos ao supracitado protocolo de exposição a FC a partir do dia 1 e foram sacrificados no dia 60
 



No fim do protocolo experimental, todos os animais foram anestesiados profundamente com uma injeção intraperitoneal de tiopental (70 mg/kg), traqueostomizados e então conectados a um ventilador para animais de pequeno porte (flexiVentT; SCIREQ, Montreal, QC, Canadá) cujos parâmetros foram volume corrente = 10 ml/kg e FR = 120 ciclos/min. Todos os animais receberam uma injeção intraperitoneal de brometo de pancurônio (0,2 mg/kg) para evitar o aumento do trabalho respiratório.(15) A impedância de entrada do sistema respiratório foi medida pela técnica de oscilações forçadas, com aplicação de uma perturbação de 16 s (com frequências de 0,25-9,125 Hz) e a válvula de expiração fechada.(16) Foi gerada pressão, e a impedância foi calculada em função das diferentes frequências. Para calcular parâmetros de mecânica respiratória, como resistência das vias aéreas, resistência tecidual e elastância tecidual, usamos um modelo de fase constante descrito anteriormente.(17)

Após o cálculo dos parâmetros supracitados, foi realizada uma incisão de 2 cm no abdome e os animais foram sacrificados por exsanguinação da aorta abdominal. Em seguida, a parede torácica anterior foi aberta e os pulmões foram removidos em bloco e fixados em formaldeído a 4% com pressão constante de 20 cmH2O durante 24 h. Foi então realizada a histologia convencional. Em suma, espécimes do lobo inferior e superior foram incluídos em para-fina e cortados em seções de 5 µm que foram coradas com hematoxilina e eosina para medir a intercepção linear média (Lm), que é um indicador do diâmetro alveolar médio.(18)

O tecido pulmonar foi imunomarcado com os seguintes anticorpos: anticorpo monoclonal de rato antimacrófago (MAC)-2 de camundongo (1:50.000; CEDARLANE®, Burlington, ON, Canadá); antimetaloproteinase da matriz (MMP)-12 de camundongo policlonal de cabra (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA) e antiglicopro-teína glicosilada de 91 kDa de camundongo policlonal de cabra (gp91phox; 1:300; Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Foi usado o método da biotina-estreptavidina-peroxidase. Os anticorpos secundários foram os kits ABC VEC-TASTAIN® anticoelho, anticabra e antirrato (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA), que também foram usados sem um anticorpo primário, servindo de controle negativo.(19)

Para a histomorfometria, um retículo ocular de 100 pontos de área conhecida foi colocado na ocular do microscópio.(20) Para cada animal, 20 campos não sobrepostos de parênquima pulmonar foram selecionados aleatoriamente e examinados por meio de microscopia de luz (aumento: 200×). A Lm foi medida por meio da contagem do número de vezes que as linhas do retículo interceptaram as paredes alveolares e foi calculada por meio da seguinte equação:

Lm = Ltotal/NI
na qual Ltotal é a soma de todos os segmentos do retículo, calculada por meio da medição de cada segmento com uma régua (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Alemanha) ao microscópio, e NI é a média do número de vezes que as linhas interceptaram as paredes alveolares. Todos os valores de Lm foram expressos em micrômetros (µm).

A histomorfometria também foi usada para determinar o número de células imunorreativas a MAC-2, MMP-12 e gp91phox no parênquima pulmonar distal e na região peribrônquica por meio de uma técnica de contagem de pontos com o retículo supracitado na ocular do microscópio (aumento: 400×). Para cada animal, foram selecionados aleato-riamente 15 campos de parênquima pulmonar e 5 vias aéreas. Os resultados foram expressos em células/µm2.(21-24)

A análise estatística foi realizada com o programa SigmaStat, versão 11 (Systat Software, Inc., San Jose, CA, EUA). Os quatro grupos de camundongos foram comparados por meio de ANOVA de uma via. As diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.

RESULTADOS

No dia 60 do protocolo experimental, não foram observadas diferenças significativas entre os quatro grupos de camundongos no tocante aos parâmetros de mecânica respiratória (isto é, resistência das vias aéreas, resistência tecidual e elastância tecidual; Figura 2). A Lm foi maior no grupo FC + EPP do que nos outros grupos (p < 0,05; Figura 3); o aumento da Lm é um atributo marcante do enfisema pulmonar.
 

 




A Figura 4 mostra o número de células positivas para MAC-2 na região peribrônquica e no parênquima pulmonar distal. Houve um aumento do número de macrófagos na região peribrônquica (p < 0,05) e no parênquima pulmonar distal (p < 0,005) no grupo FC + EPP.
 



Não houve diferenças significativas entre os quatro grupos quanto ao número de células positivas para MMP-12 na região peribrônquica (Figura 5A). No entanto, no parênquima pulmonar distal, o número de células positivas para MMP-12 foi maior no grupo FC + EPP que no grupo controle (p = 0,007; Figura 5B).
 



O número de células positivas para gp91phox na região peribrônquica foi maior no grupo FC do que nos grupos controle e EPP (p = 0,001; Figura 6A). No parênquima pulmonar distal, o número de células positivas para gp91phox foi maior no grupo FC que no grupo controle (p = 0,03), além de ter sido maior no grupo FC + EPP do que nos grupos controle e EPP (p < 0,003; Figura 6B).
 



DISCUSSÃO

No presente estudo, testamos um modelo experimental de enfisema induzido por exposição a FC em curto prazo e instilação de EPP. Após 2 meses, houve aumento da Lm, bem como infiltração de macrófagos na região peribrônqui-ca e no parênquima pulmonar distal, além de um aumento do número de células positivas para MMP-12 e gp91phox no parênquima pulmonar distal.

O fato de que não se observaram alterações funcionais no presente estudo deve-se provavelmente ao fato de que houve menos aumento alveolar em nosso estudo do que em estudos com modelos de enfisema induzido por EPP e doses mais elevadas de elastase(25) ou em estudos com modelos de enfisema induzido por FC e períodos mais lon-gos de exposição.(15) Além disso, alguns estudos mostraram que a avaliação da mecânica respiratória não reflete a presença de enfisema tão bem como a análise morfométrica.(21,26) Foronjy et al.(27) não observaram alterações da complacência pulmonar não obstante a presença de enfisema significativo, sem correlação entre o enfisema medido pela análise morfométrica e a complacência pulmonar. Os autores concluíram que essa falta de correlação ocorre porque os mecanismos envolvidos no enfisema anatômico podem ser distintos daqueles que causam a perda de retração elástica.(27)

O desequilíbrio entre a atividade das proteases e a das antiproteases no pulmão continua a ser o mecanismo mais amplamente aceito para a destruição do parênquima pulmonar no enfisema.(10,14,28-30) Além disso, estudos demons-traram que as MMPs, particularmente a MMP-12, desempenham um papel importante no ataque aos componentes proteicos da matriz extracelular do parênquima pulmonar.(31,32)

A MMP-12 é produzida principalmente por macrófagos alveolares(33) e é reconhecida como tendo um papel impor-tante no enfisema. Em um estudo, camundongos com deficiência de MMP-12 foram expostos a FC 6 dias por semana durante 6 meses e não houve aumento do número de macrófagos nem destruição parenquimatosa. (34) Além disso, há relatos de aumento da expressão da MMP-12 nos macrófagos em fumantes e de maior atividade da MMP-12 no es-carro de pacientes com DPOC do que no de fumantes sem limitação do fluxo aéreo.(35,36)

No presente estudo, houve um aumento de macrófagos na região peribrônquica e no parênquima pulmonar distal, bem como um aumento do número de células positivas para MMP-12 em comparação com o grupo controle, porém somente no parênquima pulmonar distal. Embora os níveis de MMP-12 tenham sido mais elevados nos grupos EPP e FC do que no grupo controle, a diferença não foi significativa. Esses achados são coerentes com as alterações estru-turais observadas no parênquima pulmonar distal.

No presente estudo, a Lm foi maior no grupo FC + EPP do que nos outros grupos. Já se observou um aumento se-melhante na Lm, embora somente após 6 meses de exposição a FC(15) ou com o uso do dobro da EPP usada no pre-sente estudo.(25,37)

No presente estudo, o estresse oxidativo foi medido pela determinação do número de células positivas para gp91phox, que é a subunidade de ligação ao heme da NADPH oxidase geradora de superóxido.(38) A FC contém muitos oxidantes e espécies reativas de oxigênio que promovem uma carga ambiental de oxidantes, a qual é au-mentada pela liberação adicional de oxidantes provenientes de células inflamatórias, culminando na destruição de tecido corporal.(39,40) Os macrófagos alveolares liberam mais espécies reativas de oxigênio em fumantes do que em não fumantes, e a capacidade antioxidante plasmática dos fumantes é reduzida.(39) No presente estudo, a exposição a FC resultou em um aumento das células positivas para gp91phox na região peribrônquica e no parênquima pulmo-nar distal. O número de células positivas para gp91phox na região peribrônquica foi maior no grupo FC do que nos grupos controle e EPP. Além disso, houve um aumento das células positivas para gp91phox no parênquima pulmonar distal nos grupos FC e FC + EPP. Esse aumento foi incrementado pelo uso tanto de exposição a FC como de instilação de EPP, e a presença de aumento alveolar sugere que os oxidantes desempenham um papel importante em nosso modelo murino de enfisema.

Embora o estresse oxidativo tenha sido descrito como um mecanismo importante no desenvolvimento do enfise-ma,(41-43) demonstrou-se que a NADPH oxidase desempenha um papel importante na coibição da atividade das MMPs nos macrófagos; a atividade in vitro da MMP-12 é maior em macrófagos com deficiência de oxidantes do que em macrófagos com gp91phox nula e em macrófagos de tipo selvagem.(44) Além disso, demonstrou-se in vivo que ca-mundongos com deficiência de gp91phox podem apresentar enfisema progressivo espontâneo semelhante ao obser-vado em animais de tipo selvagem expostos a FC.(44) As diferenças entre nossos resultados e os do estudo supracita-do(44) podem ser decorrentes de diferenças entre os protocolos experimentais empregados.

Nosso modelo de enfisema induzido por exposição a FC e instilação de EPP resulta em um grau significativo de destruição parenquimatosa em um período de tempo menor que o empregado em estudos anteriores, o que reforça a importância do desequilíbrio entre proteases e antiproteases e entre oxidantes e antioxidantes na patogênese do enfisema. Em virtude da diversidade de modelos experimentais na literatura, é importante escolher cuidadosamente o melhor modelo para cada propósito. Um modelo murino de enfisema induzido por exposição a FC e instilação de EPP pode ser útil para avaliar as alterações estruturais que ocorrem durante os processos de destruição e remodela-ção do parênquima pulmonar no enfisema.

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