ABSTRACT

Objective: EBUS-TBNA cytological sampling is routinely performed for pathological diagnosis, mediastinal staging, and molecular testing in lung cancer patients. EBUS-TBNA samples are not formally accepted for testing programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression. The objective of the study was to compare the feasibility, reproducibility, and accuracy of PD-L1 expression assessment in cytological specimens and histological samples. Methods: We prospectively collected histological (transbronchial forceps biopsy) and cytological (EBUS-TBNA) samples from peribronchial neoplastic lesions during an endoscopic procedure at the same target lesion for the pathological diagnosis and molecular assessment of stage IV non-small cell lung cancer (NSCLC). Results: Fifteen patients underwent the procedure. Adequate cytological samples (at least 100 neoplastic cells) were obtained in 12 cases (92.3%). Assessment of PD-L1 expression was similar between histological and cytological samples (agreement rate = 92%). Sensitivity and diagnostic accuracy of EBUS-TBNA cytological specimens were 88.9% and 100%, respectively. Conclusions: The evaluation of PD-L1 expression in EBUS-TBNA cytological specimens is feasible and presents good reproducibility when compared with routine histological samples. EBUS-TBNA cytological samples could be used for the assessment of PD-L1 expression in patients with NSCLC as a minimally invasive approach in stage IV NSCLC cancer patients.

Keywords: Ultrasonography; Biopsy, needle; Lung neoplasms; Molecular targeted therapy.

RESUMO

Objetivo: A amostragem citológica por meio de EBUS-TBNA é realizada rotineiramente para diagnóstico anatomopatológico, estadiamento mediastinal e teste molecular em pacientes com câncer de pulmão. As amostras obtidas por meio de EBUS-TBNA não são formalmente aceitas para testar a expressão da proteína programmed death-ligand 1 (PD-L1, ligante de morte celular programada 1). O objetivo do estudo foi comparar a viabilidade, reprodutibilidade e precisão da avaliação da expressão de PD-L1 em espécimes citológicos e amostras histológicas. Métodos: Foram coletadas prospectivamente amostras histológicas (obtidas por meio de biópsia transbrônquica com pinça) e citológicas (obtidas por meio de EBUS-TBNA) de lesões neoplásicas peribrônquicas durante um procedimento endoscópico na mesma lesão-alvo para o diagnóstico anatomopatológico e avaliação molecular de câncer pulmonar de células não pequenas (CPCNP) em estágio IV. Resultados: Quinze pacientes foram submetidos ao procedimento. Amostras citológicas adequadas (pelo menos 100 células neoplásicas) foram obtidas em 12 casos (92,3%). A expressão de PD-L1 nas amostras histológicas e citológicas foi semelhante (taxa de concordância = 92%). A sensibilidade e precisão diagnóstica das amostras citológicas obtidas por meio de EBUS-TBNA foram de 88,9% e 100%, respectivamente. Conclusões: A avaliação da expressão de PD-L1 em espécimes citológicos obtidos por meio de EBUS-TBNA é viável e apresenta boa reprodutibilidade quando comparada com amostras histológicas rotineiras. Amostras citológicas obtidas por meio de EBUS-TBNA podem ser usadas para avaliar a expressão de PD-L1 como uma abordagem minimamente invasiva em pacientes com CPCNP em estágio IV.

Palavras-chave: Ultrassonografia; Biópsia por agulha; Neoplasias pulmonares; Terapia de alvo molecular.

 
Apesar dos avanços das modalidades diagnósticas e métodos de imagem, o câncer de pulmão ainda é uma das principais causas de morte em todo o mundo.(1) Até 80% dos pacientes apresentam doença avançada no momento do diagnóstico, e a terapia sistêmica pode ser a única opção de tratamento.(2,3)
 
Novas estratégias terapêuticas com drogas voltadas para alvos moleculares envolvidos em alterações genéticas têm se mostrado a melhor opção de tratamento em vários cenários clínicos.(4) As terapias de alvo molecular melhoram a sobrevida de pacientes com adenocarcinoma metastático com mutações genéticas como epidermal growth factor receptor (EGFR, receptor do fator de crescimento epidérmico), ALK, ROS proto-oncogene 1 tyrosine kinase (ROS1) e rearranjo do v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B (BRAF).(5)
 
Mais recentemente, a imunoterapia com anticorpos monoclonais bloqueadores da proteína programmed death-ligand 1 (PD-L1, ligante de morte celular programada 1) tem se mostrado uma opção de tratamento promissora quanto à sobrevida global de pacientes com câncer pulmonar de células não pequenas (CPCNP) avançado em comparação com a quimioterapia-padrão.(6) Assim, a avaliação da expressão da proteína PD-L1 é essencial para identificar os pacientes que mais podem se beneficiar da imunoterapia.(7,8)
 
Nos últimos anos, procedimentos minimamente invasivos se tornaram o padrão para o diagnóstico e estadiamento de pacientes com CPCNP. Procedimentos como EBUS-TBNA frequentemente fornecem todas as informações necessárias, desde a amostragem de tecido até a avaliação molecular, e causam poucas complicações.(9-12) Espécimes citológicos obtidos por meio de EBUS-TBNA têm sido usados com sucesso para a avaliação de diversos alvos moleculares, tais como EGFR, ALK e ROS1,(8) e têm se mostrado adequados e comparáveis a amostras histológicas para a avaliação de marcadores-alvo.(13)
 
Ensaios imuno-histoquímicos diagnósticos para avaliar a expressão de PD-L1 em células tumorais foram oficialmente elaborados para testar amostras de tecido tumoral.(14) No entanto, seu uso na avaliação citológica de blocos de células não é “mundialmente” aceito, especialmente em pacientes incluídos em estudos clínicos. Portanto, o objetivo deste estudo piloto foi comparar a viabilidade e reprodutibilidade da avaliação da expressão de PD-L1 em espécimes obtidos por meio de EBUS-TBNA e espécimes histológicos.
 
MÉTODOS
 
O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da instituição, e todos os participantes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido.
 
Pacientes com suspeita de CPCNP avançado (estágio IV) foram submetidos a broncoscopia para definição anatomopatológica, e foi realizada a avaliação molecular das lesões pulmonares. Os pacientes foram selecionados com base na identificação de lesões na TC com alta probabilidade de amostragem tanto por EBUS-TBNA como por biópsia transbrônquica. Durante o procedimento, amostras histológicas (biópsia transbrônquica) e citológicas (EBUS-TBNA) foram extraídas da mesma lesão neoplásica peribrônquica. O fluxograma do procedimento é apresentado na Figura 1.

 
Quinze pacientes consecutivos submetidos à broncoscopia para o diagnóstico anatomopatológico e avaliação da expressão molecular de PD-L1 foram incluídos na análise. Foram considerados adequados os espécimes com pelo menos 100 células tumorais viáveis. Amostras com menos de 100 células tumorais viáveis foram consideradas inadequadas e foram excluídas da análise.(15)
 
Amostras obtidas por EBUS-TBNA
 
As amostras obtidas por meio de EBUS-TBNA foram extraídas de lesões peribrônquicas adjacentes às vias aéreas. O procedimento foi realizado sob anestesia local (lidocaína a 1%) e sedação moderada realizada por um anestesiologista. A ventilação foi espontânea. Todos os procedimentos foram realizados pela mesma equipe de pneumologistas intervencionistas com uma sonda convexa (EBUS Convex Probe BF-UC180F; Olympus Europa SE & Co. KG, Hamburgo, Alemanha) e um processador de ultrassom exclusivo (EU-ME2; Olympus Europa SE & Co. KG). Os espécimes obtidos por meio de EBUS-TBNA foram extraídos com uma agulha de calibre 22 específica para esse fim (Vizishot NA-201SX-4022; Olympus Europa SE & Co. KG).
 
Uma quantidade bem pequena do material aspirado foi empurrada para fora pelo estilete interno e montada em lâminas de vidro, seca ao ar e corada pelo método modificado de May-Grünwald-Giemsa (Diff-Quik) para rapid on-site evaluation (ROSE, avaliação rápida no local). O restante do aspirado e outras passagens da agulha — no mínimo 3, variando de 3 a 5 de acordo com a porcentagem de células tumorais no esfregaço (ROSE) — foram colocados em solução salina para processamento dos blocos de células e avaliação citológica adicional.(10)
 
Amostras histológicas
 
A biópsia transbrônquica foi realizada por meio da introdução de uma pinça endoscópica grande (2,8 mm) na lesão pulmonar. Lesões pulmonares neoplásicas foram previamente confirmadas por meio de sonda radial de EBUS e fluoroscopia, e a bainha guia (SG-201-C; Olympus Europa SE & Co. KG) foi usada para manter a pinça na posição correta. Não foi realizada a biópsia de lesões endobrônquicas visíveis.
 
A primeira amostra obtida por biópsia foi esfregada em uma lâmina de vidro para “impressão” (imprinting) da biópsia e avaliação citológica imediata (ROSE) quanto à adequação do espécime. Assim que se confirmava a adequação do espécime, mais biópsias eram realizadas e imediatamente fixadas em formalina para a avaliação histológica, conforme descrito anteriormente.(16)
 
Aspectos técnicos de PD-L1 e imuno-histoquímica
 
Blocos de células provenientes de espécimes obtidos por meio de EBUS-TBNA foram preparados sem fixador à base de metanol. O material citológico foi centrifugado, corado com H&E, revestido com agarose líquida para formar um bloco firme de células e finalmente processado em conformidade com métodos histopatológicos usados como padrão para amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina.(17)
 
Dez cortes consecutivos de 2 a 3 mm de espessura foram obtidos de cada bloco de células; o primeiro e o último corte foram corados com H&E para garantir que células tumorais diagnósticas estivessem presentes em todas as lâminas. Em alguns casos, a fim de diferenciar adenocarcinoma de carcinoma de células escamosas, foi realizada a análise imunocitoquímica de thyroid transcription factor-1 (fator de transcrição tireoidiano 1) e p40 (um anticorpo que reconhece ΔNp63, uma isoforma de p63 altamente específica para células escamosas/basais).(18)
 
A expressão de PD-L1 foi avaliada com o kit PD-L1 IHC 22C3 pharmDx (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), um ensaio imuno-histoquímico qualitativo com anticorpo monoclonal murino anti-PD-L1, clone 22C3, com o sistema de visualização EnVision FLEX em Autostainer Link 48 (Agilent Technologies).(15)
 
Foram considerados adequados os espécimes com pelo menos 100 células tumorais viáveis. Em cada caso, calculou-se o tumor proportion score (TPS). O TPS é a proporção de células tumorais viáveis que apresentam coloração parcial ou completa da membrana. O TPS era considerado negativo quando a proporção de células coradas era < 1%, fracamente positivo quando a proporção de células coradas era = 1-49% e fortemente positivo quando a proporção de células coradas era ≥ 50%.
 
Dois patologistas experientes examinaram todas as amostras de forma independente. As divergências foram discutidas e resolvidas por consenso. As amostras obtidas por meio de biópsia com pinça foram processadas em conformidade com o padrão para métodos histopatológicos.
 
Análise estatística
 
Os dados contínuos foram relatados em forma de médias e desvios-padrão. Os dados categóricos e numéricos foram apresentados em forma de frequência absoluta e relativa. Amostras inadequadas (amostras de biópsia adequadas com > 100 células viáveis, porém amostras inadequadas de EBUS-TBNA) foram excluídas da análise de precisão porque o objetivo do estudo era mostrar concordância entre as amostras. Para testar a correlação entre as classes de risco, foi usado o teste de correlação de postos de Spearman. Uma curva ROC foi gerada para determinar o melhor limite. O nível de significância adotado foi de p < 0,05. A análise estatística foi realizada com o programa RStudio, versão 3.6.1 “Action of the Toes” (RStudio Inc., Boston, MA, EUA), com os pacotes standard, rcmdr e irr.(19,20)
 
RESULTADOS
 
Quinze pacientes foram incluídos no estudo. Amostras adequadas (pelo menos 100 células neoplásicas viáveis) foram obtidas de espécimes citológicos e histológicos em 12 pacientes (80%). As características demográficas dos pacientes foram: 13 pacientes do sexo masculino (83,3%); mediana da idade = 66 anos (variação: 54-78 anos). No tocante aos tipos de células tumorais, adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas foram identificados em 11 e 4 pacientes, respectivamente. Os resultados histológicos e citológicos da expressão de PD-L1 são apresentados na Tabela 1.

 
Três pacientes com amostras inadequadas foram incluídos na análise agregada, porém excluídos da análise de precisão. Em 11 pacientes, houve concordância completa entre os resultados citológicos e histológicos da expressão de PD-L1, independentemente dos subtipos: adenocarcinoma, em 9 pacientes (Figura 2); carcinoma de células escamosas, em 2 (Figura 3). Em um caso (adenocarcinoma), houve resultados divergentes (citologia negativa e histologia fracamente positiva). Os resultados da expressão de PD-L1 em amostras citológicas obtidas por meio de EBUS-TBNA apresentaram área sob a curva ROC = 0,79 (Figura 4A). A sensibilidade, precisão diagnóstica e valor preditivo negativo foram = 88,9%, 91,7% e 75,0%, respectivamente. A coloração para PD-L1 apresentou reação negativa, reação fracamente positiva e reação fortemente positiva em 16,7%, 16,7% e 66,7% das amostras histológicas, respectivamente, e em 25,0%, 8,3% e 66,7% das amostras citológicas.

 
Com os diferentes pontos de corte para a expressão de PD-L1, a concordância entre espécimes histológicos e citológicos considerados negativos, fracamente positivos e fortemente positivos foi de 80%, 67% e 100%, respectivamente. O teste de correlação de postos de Spearman mostrou uma correlação altamente significativa entre o TPS das amostras histológicas e citológicas (rho = 0,836; p = 0,0060; Figura 4B).
 
DISCUSSÃO
 
Atualmente, EBUS-TBNA faz parte da prática clínica rotineira diária em diversas doenças torácicas.(10) Como é pouco invasiva e possibilita a obtenção de repetidas amostras, a EBUS-TBNA é frequentemente o procedimento de escolha para o diagnóstico anatomopatológico e avaliação molecular em pacientes com CPCNP em estágio avançado.(21) Até 80% dos pacientes com CPCNP apresentam doença avançada no momento do diagnóstico e são possíveis candidatos a tratamento farmacológico direcionado.(2) Em nossa experiência, até 98,5% dos pacientes são diagnosticados com um procedimento minimamente invasivo que fornece espécimes citológicos e blocos de células.(10)
 
A abordagem oncológica moderna combina procedimentos minimamente invasivos com tratamentos oncológicos menos invasivos para melhor sobrevida e menores taxas de complicações. Na era da terapia de alvo molecular, é essencial que se elabore a melhor modalidade possível, que permita a aquisição de quantidades suficientes de tecido de alta qualidade sem cirurgia. O teste molecular é fundamental para o manejo de pacientes com CPCNP, especialmente para o direcionamento da terapia específica com inibidores de tirosina quinase voltados para EGFR e outros marcadores moleculares.(8) Mutações que podem ser alvo de terapia molecular, tais como a do gene EGFR, foram inicialmente avaliadas em espécimes histológicos até que se demonstrasse que também poderiam ser avaliadas em espécimes obtidos por meio de EBUS-TBNA com sensibilidade equivalente.(13)
 
Nos últimos anos, a imunoterapia para o tratamento de câncer de pulmão com agentes voltados para vias de correceptores imunes como PD-L1 tem apresentado resultados promissores, com respostas clínicas prolongadas e toxicidade tolerável.(6)
 
A seleção de pacientes que podem se beneficiar da imunoterapia é obrigatória no CPCNP avançado,(22) e PD-L1 é o único biomarcador validado e aprovado como ferramenta diagnóstica auxiliar antes da imunoterapia na prática clínica. Juntamente com EGFR, BRAF, ALK e ROS1, PD-L1 é um biomarcador obrigatório a ser avaliado em amostras usadas para o diagnóstico anatomopatológico de CPCNP de modo que se possa oferecer a melhor estratégia de tratamento. Também são recomendados outros marcadores, tais como HER2, KRAS, RET e MET 14 exon skipping mutation (mutação que resulta na perda da transcrição do éxon 14 do gene MET).(23)
 
Até o momento, o padrão ouro para a avaliação da expressão de PD-L1 é a imuno-histoquímica realizada em espécimes histológicos fixados em formalina e incluídos em parafina,(24) e há poucas evidências de que a expressão de PD-L1 possa ser avaliada de forma confiável em espécimes citológicos obtidos por meio de EBUS-TBNA na prática clínica diária. Um estudo anterior(25) relatou a viabilidade da avaliação citológica de PD-L1 em uma variedade de 30 preparações citológicas a partir de amostras extraídas de pacientes com CPCNP. Os autores concluíram que os blocos de células poderiam substituir o tecido histológico na determinação da expressão de PD-L1 em pacientes com CPCNP. No entanto, o estudo avaliou diferentes tipos de espécimes citológicos envolvendo diferentes tipos de tumores, diferentes locais de coleta e diferentes processos analíticos laboratoriais, que resultaram em diversos vieses.(25)
 
Outro estudo(26) relatou uma comparação entre amostras citológicas e histológicas. O estudo apresentou um viés considerável relacionado com a falta de padronização das amostras citológicas e histológicas. As amostras citológicas foram extraídas de diferentes locais com diferentes tipos de agulha, e as amostras histológicas foram extraídas de muitos locais diferentes, inclusive biópsias com agulha. Além disso, as amostras citológicas e histológicas não foram coletadas ao mesmo tempo. Foram incluídos na análise diferentes subtipos patológicos, inclusive mesotelioma maligno e metástases que não câncer de pulmão. Como se sabe, a expressão de PD-L1 em tumores é dinâmica e pode mudar ao longo do tempo e de acordo com diferentes sítios tumorais; portanto, coletar amostras em momentos diferentes pode gerar um viés na análise da expressão de PD-L1. (7) No presente estudo, avaliamos prospectivamente a viabilidade da expressão de PD-L1 em amostras obtidas por meio de EBUS-TBNA, comparando-as com espécimes histológicos da mesma lesão coletados ao mesmo tempo, evitando assim qualquer tipo de viés de coleta ou seleção que pudesse alterar o perfil de expressão de PD-L1.
 
Nossos resultados mostraram uma excelente concordância entre os espécimes citológicos e histológicos na avaliação da expressão de PD-L1 em espécimes de CPCNP. A concordância entre os espécimes histológicos e citológicos no que tange à expressão de PD-L1 foi de 80%, 67% e 100%, respectivamente, para resultados negativos, fracamente positivos e fortemente positivos. Em um caso, houve resultados divergentes: citologia negativa (< 1%) e histologia fracamente positiva focal (2%). Excluímos amostras inadequadas (biópsia adequada com > 100 células tumorais viáveis, porém amostras obtidas por meio de EBUS-TBNA com < 100 células viáveis). Amostras inadequadas apresentaram relação com a presença de sangue em excesso ou necrose no bloco de células.
 
Este estudo piloto tem limitações. A principal limitação foi o pequeno número de pacientes incluídos na análise. Não é muito comum selecionar pacientes com lesões peribrônquicas passíveis de biópsia com pinça e EBUS-TBNA, mas era obrigatório para excluir qualquer possível viés de amostragem. Outra limitação do estudo está relacionada com a reprodutibilidade dos resultados da expressão de PD-L1 em espécimes linfonodais obtidos por meio de EBUS-TBNA. Embora possa haver diferença entre o tumor primário e a metástase linfonodal quanto à expressão de PD-L1, há relatos de boa concordância (70-90%) com pontos de corte clinicamente relevantes.(24)
 
No presente estudo, embora a amostra tenha sido pequena, a viabilidade e reprodutibilidade dos resultados da expressão de PD-L1 em espécimes obtidos por meio de EBUS-TBNA demonstraram que é possível obter amostra de tecido suficiente por meio de um único procedimento para diagnóstico anatomopatológico, estadiamento e avaliação molecular completa, o que forma a base da era da terapia personalizada que combina procedimentos minimamente invasivos com agentes imunobiológicos para que se obtenham os melhores resultados oncológicos. A boa concordância entre as amostras histológicas e citológicas mostra resultados promissores para a avaliação da expressão de PD-L1 em espécimes obtidos por meio de EBUS-TBNA. Mais estudos são necessários para confirmar essa evidência.
 
AGRADECIMENTOS
 
Gostaríamos de agradecer à Sra. Susan Jane West, tradutora profissional de inglês, a revisão do manuscrito.
 
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES
 
JG e LS: concepção e desenho do estudo; materiais ou encaminhamento de pacientes. LS: concepção e desenho do estudo. FDM e SMD: materiais ou encaminhamento de pacientes. EGR, CDT e MB: coleta/compilação dos dados. LB e MC: análise e interpretação dos dados. GS: apoio administrativo. Todos os autores: redação e revisão do manuscrito; aprovação da versão final.

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