ABSTRACT

Objective: To investigate the effects of N-acetylcysteine (NAC) and pentoxifylline in a model of remote organ injury after hind-limb ischemia/reperfusion (I/R) in rats, the lungs being the remote organ system. Methods: Thirty-five male Wistar rats were assigned to one of five conditions (n = 7/group), as follows: sham operation (control group); hind-limb ischemia, induced by clamping the left femoral artery, for 2 h, followed by 24 h of reperfusion (I/R group); and hind-limb ischemia, as above, followed by intraperitoneal injection (prior to reperfusion) of 150 mg/kg of NAC (I/R+NAC group), 40 mg/kg of pentoxifylline (I/R+PTX group), or both (I/R+NAC+PTX group). At the end of the trial, lung tissues were removed for histological analysis and assessment of oxidative stress. Results: In comparison with the rats in the other groups, those in the I/R group showed lower superoxide dismutase activity and glutathione levels, together with higher malondialdehyde levels and lung injury scores (p < 0.05 for all). Interstitial inflammatory cell infiltration of the lungs was also markedly greater in the I/R group than in the other groups. In addition, I/R group rats showed various signs of interstitial edema and hemorrhage. In the I/R+NAC, I/R+PTX, and I/R+NAC+PTX groups, superoxide dismutase activity, glutathione levels, malondialdehyde levels, and lung injury scores were preserved (p < 0.05 for all). The differences between the administration of NAC or pentoxifylline alone and the administration of the two together were not significant for any of those parameters (p > 0.05 for all). Conclusions: Our results suggest that NAC and pentoxifylline both protect lung tissue from the effects of skeletal muscle I/R. However, their combined use does not appear to increase the level of that protection.

Keywords: Skeletal muscle; Ischemia; Reperfusion injury; Lung injury; Acetylcysteine; Pentoxifylline.

RESUMO

Objetivo: Investigar os efeitos da N-acetilcisteína (NAC) e pentoxifilina em um modelo de lesão pulmonar remota após isquemia/reperfusão (I/R) de membro posterior em ratos. Métodos: Trinta e cinco ratos Wistar machos foram divididos em cinco grupos (n = 7/grupo), cada qual submetido ao seguinte: operação simulada (grupo controle); isquemia de membro posterior, induzida por pinçamento da artéria femoral esquerda por 2 h, seguida por de 24 h de reperfusão (grupo I/R); e isquemia de membro posterior, como descrito acima, seguida de injeção intraperitoneal (antes da reperfusão) de 150 mg/kg de NAC (grupo I/R+NAC), 40 mg/kg de pentoxifilina (grupo I/R+PTX) ou ambas (grupo I/R+NAC+PTX). Ao final do experimento, tecidos pulmonares foram removidos para análise histológica e avaliação do estresse oxidativo. Resultados: Comparados aos ratos dos outros grupos, os do grupo I/R apresentaram menor atividade de superóxido dismutase e menores níveis de glutationa, além de maiores níveis de malondialdeído e maiores escores de lesão pulmonar (p < 0,05 para todos). Infiltração celular inflamatória intersticial dos pulmões também foi bem maior no grupo I/R do que nos outros grupos. Além disso, os ratos do grupo I/R apresentaram vários sinais de edema intersticial e hemorragia. Nos grupos I/R+NAC, I/R+PTX e I/R+NAC+PTX, a atividade de superóxido dismutase, níveis de glutationa, níveis de malondialdeído e escores de lesão pulmonar foram preservados (p < 0,05 para todos). As diferenças entre a administração de NAC ou pentoxifilina isoladamente e a das duas combinadas não foi significativa para nenhum desses parâmetros (p > 0,05 para todos). Conclusões: Nossos resultados sugerem que tanto NAC quanto pentoxifilina protegem o tecido pulmonar dos efeitos de I/R de músculo esquelético. Entretanto, seu uso combinado não parece aumentar o nível dessa proteção.

Palavras-chave: Músculo esquelético; Isquemia; Traumatismo por reperfusão; Lesão pulmonar; Acetilcisteína; Pentoxifilina.

INTRODUÇÃO

O restabelecimento da perfusão em um tecido após um período de isquemia piora a lesão isquêmica inicial. Esse processo é denominado lesão de isquemia/reperfusão (I/R).(1) Esse tipo de lesão é um evento clínico importante e é comum nas extremidades inferiores. Embora a restauração do fluxo sanguíneo possa salvar a extremidade, pode também resultar em síndrome de disfunção de múltiplos órgãos.(2) Por exemplo, a I/R de um membro inferior resulta em edema pulmonar não cardiogênico por meio de vasoconstrição pulmonar, hipertensão pulmonar e aumento da permeabilidade da membrana alveolar. (3) A disfunção pulmonar após a lesão de I/R de uma extremidade inferior continua a ser uma das principais causas de morbidade e mortalidade. (4) Estudos anteriores sugeriram que radicais livres de oxigênio, mediadores inflamatórios e, em especial, neutrófilos desempenham um papel importante na lesão pulmonar relacionada com I/R em um membro inferior.(5,6)

Diversos agentes reduzem a lesão pulmonar remota após a I/R dos membros posteriores de ratos.(7-9) A N-acetilcisteína (NAC) é um antioxidante que aumenta os níveis intracelulares de glutationa e realiza a eliminação direta de espécies reativas de oxigênio (ERO) como ácido hipocloroso, peróxido de hidrogênio, superóxido e radical hidroxila.(10) Demonstrou-se que a pentoxifilina, um inibidor não específico da fosfodiesterase, melhora a oxigena-ção tecidual e a função endotelial, além de inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias.(11) A pentoxifilina inibe também a proliferação celular e a acumulação de matriz extracelular.(12) Portanto, no presente estudo, avaliou-se, por meio da análise dos efeitos da pentoxifilina, da NAC e da combinação de ambas, o possível envolvimento do estresse oxidativo na lesão pulmonar induzida por I/R de músculo esquelético em ratos.

MÉTODOS

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com diretrizes estabelecidas de tratamento éti-co de animais experimentais, e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Tratamento e Uso de Animais da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Azad Islâmica, na cidade de Teerã, no Irã.

Trinta e cinco ratos Wistar machos adultos saudáveis com 90-120 dias de idade e 250-350 g de peso foram com-prados do Instituto Pasteur do Irã. Os animais foram mantidos em um ambiente com temperatura e umidade contro-ladas (22 ± 1°C; umidade relativa: 50 ± 5%), em ciclo claro-escuro de 12 h, com ração comercial em forma de pellet e água de torneira filtrada à vontade. Os animais foram aleatoriamente divididos em cinco grupos experimentais de sete ratos cada: grupo I/R, no qual os animais foram submetidos a 2 h de isquemia de membro posterior, induzida por meio de pinçamento da artéria femoral esquerda, seguida de administração, por via intraperitoneal, de 2 ml de solução salina a 0,9% e 24 h de reperfusão; grupo operação simulada (controle), no qual os animais foram submeti-dos a todos os procedimentos cirúrgicos exceto oclusão arterial e receberam solução salina a 0,9% (2 ml, i.p.); grupo I/R+NAC, no qual os animais foram submetidos a I/R conforme descrito acima e receberam 150 mg/kg de NAC em solução salina a 0,9% (i.p., em um volume total de 2 ml); grupo I/R+PTX, no qual os animais foram submetidos a I/R conforme descrito acima e receberam 40 mg/kg de pentoxifilina em solução salina a 0,9% (i.p., em um volume total de 2 ml); grupo I/R+NAC+PTX, no qual os animais foram submetidos a I/R conforme descrito acima e receberam tanto NAC como pentoxifilina (nas doses indicadas acima) em solução salina a 0,9% (i.p., em um volume total de 2 ml).

Os ratos foram pesados e depois anestesiados com cloridrato de cetamina a 10% e cloridrato de xilazina a 2% (i.m., 50 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente). Os animais foram colocados sobre uma almofada de aquecimento, em decúbito dorsal, com o tórax e os membros posteriores imobilizados com fita adesiva. Após a preparação cirúrgica asséptica, 250 UI de heparina foram administradas pela veia jugular (a fim de evitar coagulação) e uma incisão cutânea foi feita na face medial do membro posterior esquerdo. Após o isolamento da artéria femoral esquerda dos tecidos circundantes, a isquemia foi induzida por meio de uma pinça microvascular para ocluir a artéria durante 2 h. Durante todo o período de isquemia, os animais foram mantidos em decúbito dorsal e permaneceram anestesiados (doses adicionais administradas conforme necessário). A temperatura corporal foi monitorada por meio de um ter-mômetro retal. No fim do período de isquemia, a pinça foi removida e o sítio cirúrgico foi suturado de modo rotineiro com fio de polipropileno 4/0. Os animais do grupo controle foram submetidos a um procedimento cirúrgico seme-lhante, porém sem oclusão arterial. Os ratos submetidos a isquemia foram em seguida submetidos a 24 h de reperfu-são. Ao longo dos períodos de isquemia e reperfusão, os animais receberam suporte ventilatório não invasivo.

No fim do período experimental, todos os ratos foram sacrificados por meio de uma overdose de pentobarbital (300 mg/kg, i.p.) e os pulmões foram removidos em bloco. Os pulmões esquerdos foram imersos em solução de formalina a 10%, e os pulmões direitos foram armazenados a −20°C para análise bioquímica subsequente. As amostras de tecido pulmonar homogeneizado e sobrenadante foram preparadas conforme descrito por Yildirim et al.(13) Os níveis de malondialdeído, a atividade de superóxido dismutase (SOD) e os níveis de glutationa foram medidos nos pul-mões direitos, ao passo que amostras dos pulmões esquerdos foram submetidas a avaliação histopatológica por meio de microscopia de luz.

Os níveis de malondialdeído foram determinados por meio da reação ao ácido tiobarbitúrico, conforme descreveu Yagi.(14) No teste de reação ao ácido tiobarbitúrico, o malondialdeído (ou substâncias semelhantes) reage(m) com o ácido tiobarbitúrico e produz(em) um cromógeno rosa com pico de absorbância a 532 nm no espectrofotômetro. Os níveis teciduais de malondialdeído são expressos em nmol/g de tecido.

A atividade de SOD foi determinada de acordo com o método elaborado por Winterbourn et al.,(15) pela inibição da redução fotoquímica do azul de nitrotetrazólio a 560 nm. A atividade de SOD é expressa em U/g de tecido.

Os níveis de glutationa foram determinados pelo método descrito por Ellman,(16) segundo o qual o nível de glutati-ona é considerado diretamente proporcional à taxa de formação do cromógeno reduzido, ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico), que se determina por meio da medição de sua absorbância a 412 nm. Os resultados são expressos em nmol/g de tecido.

Os espécimes de pulmão esquerdo foram fixados em formalina tamponada a 10%, processados por meio de técni-cas convencionais e incluídos em parafina. Foram feitos cortes transversais de 5 µm de espessura nas zonas médias dos pulmões, e as seções foram montadas em lâminas. As lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina e, em seguida, examinadas por meio de microscopia de luz por um patologista que desconhecia os grupos. A lesão pulmo-nar foi avaliada semiquantitativamente por meio da classificação de Koksel et al.(17): grau 0, aparência normal; grau 1, congestão intersticial e infiltração de neutrófilos de leve a moderada; grau 2, edema perivascular, destruição parcial da arquitetura pulmonar e moderada infiltração de neutrófilos; grau 3, destruição completa da arquitetura pulmonar e densa infiltração de neutrófilos. Cinco lâminas de cada amostra de pulmão foram avaliadas aleatoria-mente, e a média foi aceita como o valor representativo da amostra.

Todos os resultados são apresentados em forma de média ± desvio padrão. Os resultados analíticos foram avalia-dos por meio do programa Statistical Package for the Social Sciences, versão 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). A análise estatística foi realizada por meio de análise de variância. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisti-camente significativos.

RESULTADOS

Como se pode observar na Figura 1, os níveis de malondialdeído foram significativamente maiores no grupo I/R do que em qualquer um dos demais grupos (p < 0,05). Além disso, os níveis de malondialdeído foram menores no grupo I/R+NAC+PTX do que nos grupos I/R+NAC e I/R+PTX, embora as diferenças não tenham sido estatisticamen-te significativas. A atividade de SOD foi significativamente menor no grupo I/R do que no grupo controle (Figura 2) e significativamente maior nos grupos I/R+NAC, I/R+PTX e I/R+NAC+PTX do que no grupo I/R (p < 0,05). Embora a maior atividade de SOD tenha sido observada no grupo I/R+NAC+PTX, não houve diferenças significativas entre os grupos I/R+PTX, I/R+NAC e I/R+NAC+PTX quanto à atividade de SOD. Os níveis de glutationa também foram signi-ficativamente menores no grupo I/R do que no grupo controle (Figura 3) e significativamente maiores nos grupos I/R+NAC, I/R+PTX e I/R+NAC+PTX do que no grupo I/R. Embora os níveis de glutationa tenham sido maiores no grupo I/R+NAC+PTX do que nos grupos I/R+NAC e I/R+PTX, as diferenças entre esses três grupos não foram signi-ficativas. As médias da pontuação relativa à histopatologia pulmonar são apresentadas, por grupo, na Figura 4. A média da pontuação do grupo I/R foi significativamente menor do que a média da pontuação dos grupos I/R+NAC, I/R+PTX e I/R+NAC+PTX, embora não tenha havido diferenças significativas entre os três grupos tratados quanto à pontuação relativa à lesão pulmonar. Como se pode observar na Figura 5, a infiltração celular inflamatória interstici-al foi muito mais pronunciada nas amostras de pulmão dos ratos do grupo I/R do que nas dos ratos dos demais gru-pos. Os pulmões dos ratos do grupo I/R apresentaram também vários sinais de edema intersticial e hemorragia.
 

 


 


 


 





DISCUSSÃO

O pinçamento das artérias periféricas é rotineiramente usado em casos de cirurgia ortopédica ou trauma ortopédi-co, em procedimentos eletivos e de emergência. Demonstrou-se que a oclusão arterial transitória pode danificar os pulmões. O dano isquêmico resulta de uma diminuição do fluxo sanguíneo em um órgão. Quando o fluxo sanguíneo é restaurado, ocorre um dano maior, denominado lesão de reperfusão. Sugeriu-se que o estresse oxidativo desem-penha um papel na lesão de I/R.(18) Diversos marcadores teciduais de estresse oxidativo foram medidos a fim de avaliar os efeitos da lesão de I/R. Sabe-se que as ERO, que são potentes agentes oxidantes e redutores que podem danificar diretamente as membranas celulares por meio de peroxidação lipídica, são produzidas em excesso durante o estresse oxidativo.(19) A peroxidação de lipídios endógenos leva à conversão de glutationa reduzida em dissulfeto de glutationa.(20) O malondialdeído é um produto final derivado da peroxidação de ácidos graxos poli-insaturados e ésteres afins. Portanto, os níveis teciduais de malondialdeído são um reflexo válido da peroxidação lipídica. Outra linha de defesa celular contra radicais livres é um sistema de três enzimas: SOD, catalase e glutationa peroxidase. A SOD catalisa a conversão de superóxidos em peróxido de hidrogênio, que é subsequentemente convertido em água e oxigênio pela catalase ou glutationa peroxidase. Como a SOD desempenha um papel tão importante na defesa celular contra os radicais livres, é também um importante indicador do estado oxidativo.(21)

A NAC é um precursor da glutationa; é uma molécula pequena que contém um grupo tiol, que possui propriedades antioxidantes, e é livremente filtrável com pronto acesso aos compartimentos intracelulares.(22) A diversidade de aplicações farmacológicas da NAC deve-se principalmente às propriedades químicas do grupo tiol cisteínil de sua molécula; a capacidade de grupos tiol reduzidos de eliminar radicais livres de oxigênio já está bem estabelecida.(23-25) Além disso, a NAC tem uma variedade de efeitos anti-inflamatórios.(26,27) Estudos anteriores com ratos demonstra-ram que a administração de NAC em doses de aproximadamente 400 mg/kg protege os órgãos de danos oxidati-vos.(28,29) No presente estudo, verificou-se que, em comparação com a ausência de tratamento, a administração de NAC após a isquemia (antes da reperfusão) resultou em menores níveis de malondialdeído, maior atividade de SOD e maiores níveis de glutationa. Em outras palavras, a NAC atenuou de maneira eficaz o aumento do nível de malon-dialdeído induzido por I/R.

A pentoxifilina é um derivado da metilxantina com várias propriedades hemorreológicas. A pentoxifilina aumenta o monofosfato cíclico de adenosina intracelular nas hemácias e, assim, melhora a oxigenação dos tecidos isquêmicos, aumenta o monofosfato cíclico de adenosina nos leucócitos polimorfonucleares e diminui a produção de radicais livres de oxigênio.(30-33) Relatos recentes sugerem que a pentoxifilina é capaz de aumentar a resposta quimiotática dos neutrófilos e inibir a fagocitose e a produção de superóxidos por neutrófilos e monócitos.(34) Esses achados tra-duziram-se em benefícios clínicos: a pentoxifilina já foi usada para atenuar a lesão de I/R em pacientes com dano pulmonar, intestinal ou renal.(31) Estudos anteriores demonstraram que a administração de 50 mg/kg de pentoxifilina tem o efeito benéfico de reduzir o estresse oxidativo e índices inflamatórios em casos de lesão da medula espinhal induzida por I/R e doença hepática gordurosa.(35,36) No presente estudo, a administração de pentoxifilina após a isquemia (antes da reperfusão) resultou em menores níveis de malondialdeído, maior atividade de SOD e maiores níveis de glutationa em comparação com a ausência de tratamento.

Em suma, o significativo aumento dos níveis de malondialdeído, a significativa redução dos níveis de glutationa e a aparência destrutiva na histologia pulmonar após I/R sugerem que a lesão pulmonar induzida por I/R de músculo esquelético é mediada por reações de oxidação. Os resultados de nosso estudo confirmam que tanto a pentoxifilina como a NAC oferecem proteção contra a lesão de I/R. Esses efeitos podem ser atribuídos, pelo menos parcialmente, à inibição da produção de ERO. Até onde sabemos, este foi o primeiro estudo a comparar os efeitos dessas duas substâncias na lesão pulmonar remota. As propriedades antioxidantes da pentoxifilina mostraram-se comparáveis às da NAC. No entanto, não se observou nenhum efeito adicional quando ambas foram administradas juntas. Mais estu-dos são necessários para determinar a importância clínica do tratamento com pentoxifilina e NAC, especialmente no que tange aos possíveis mecanismos além da eliminação de ERO. Tais tratamentos podem se mostrar eficazes em reforçar a proteção dos pulmões após a I/R dos membros inferiores.

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