ABSTRACT

Objective: This study aimed to determine the serum levels of NACHT, Leucine-rich repeat (LRR), and Pyrin (PYD) domains-containing Protein 3 (NLRP3) and cathelicidin LL-37, and investigate their prognostic significance in community-acquired pneumonia (CAP). Methods: The sample of this prospective study was composed of 76 consecutive patients with CAP. Demographic data and clinical characteristics were collected. Serum levels of NLRP3 and LL-37 were determined by ELISA. Spearman's analysis was used to evaluate the correlation between NLRP3 and LL-37. Association of NLRP3 and LL 37 with 30-day survival and mortality rates was assessed using the Kaplan-Meier curve and logistic regression analysis. Results: Serum NLRP3 significantly increased whereas serum LL-37 significantly decreased in patients with severe CAP. Significant correlation was observed between serum NLRP3 and LL-37 in CAP patients. Patients with higher levels of NLRP3 and lower levels of LL-37 showed lower 30-day survival rate and higher mortality compared with those with lower NLRP3 and higher LL-37 levels. Conclusion: Severe CAP patients tend to present higher serum NLRP3 and lower serum LL-37, which might serve as potential biomarkers for CAP prognosis.

Keywords: Community-acquired pneumonia; Prognosis; Biomarkers; Prospective study.

RESUMO

Objetivo: Este estudo teve como objetivo determinar os níveis séricos de proteína 3 contendo um domínio NACHT, porção C-terminal rica em repetições de leucina e de domínio pirina (NLRP3) e catelicidina LL-37, bem como investigar sua importância prognóstica em pneumonia adquirida na comunidade (PAC). Métodos: Este estudo prospectivo incluiu 76 pacientes com PAC. Foram obtidos dados demográficos e características clínicas. Os níveis séricos de NLRP3 e LL-37 foram determinados por meio do teste ELISA. A correlação entre NLRP3 e LL-37 foi estimada por intermédio da análise de Spearman. A associação entre NLRP3 e LL-37 com 30 dias de taxa de sobrevida e de mortalidade foi avaliada pela curva de Kaplan-Meier e análise de regressão logística. Resultados: Os níveis séricos de NLRP3 estavam elevados, enquanto os níveis de LL-37 apresentaram redução significativa em pacientes com PAC grave. Observou‑se correlação significativa entre os níveis séricos de NLRP3 e LL-37 em pacientes com PAC. Pacientes com níveis elevados de NLRP3 e níveis reduzidos de LL-37 exibiram maior taxa de sobrevida em 30 dias e de mortalidade quando comparados com aqueles com níveis inferiores de NLRP3 e LL-37. Conclusões: Pacientes com PAC grave tendem a apresentar níveis séricos elevados de NLRP3 e níveis reduzidos de LL-37, o que pode ser utilizado como um potencial biomarcador prognóstico.

Palavras-chave: Pneumonia adquirida na comunidade; Prognóstico; Biomarcadores ; Estudo prospectivo.

INTRODUÇÃO

A pneumonia é reconhecida como um importante problema de saúde pública e uma das causas mais comuns de hospitalização e de morte ao redor do mundo, sendo classificada como pneumonia adquirida na comunidade (PAC) ou pneumonia adquirida em hospital, de acordo com o ambiente de infecção.(1,2) Doenças pulmonares parenquimatosas que ocorrem fora de um ambiente hospitalar têm sido tradicionalmente categorizadas como PAC, apresentando significante morbidade e mortalidade. A incidência de PAC varia de 0,33% a 4,6% ao ano na população idosa, dependendo das condições de comorbidade e gravidade da PAC.(3-5) Avanços nos cuidados médicos têm permitido uma sobrevida aos pacientes com PAC grave, porém, para a maioria deles, as melhorias nos tratamentos são imperceptíveis.(6) Portanto, a busca por melhores biomarcadores é um tópico importante.

Até o momento, vários biomarcadores séricos foram descobertos para prever a gravidade da doença e o prognóstico para pacientes com PAC. Por exemplo, Kolditz et al.(7) realizaram um estudo prospectivo para demonstrar que o cortisol sérico prediz a mortalidade e a doença crítica em pacientes com PAC, independentemente dos escores clínicos e dos biomarcadores inflamatórios. Angus et al.(8) descobriram que os níveis do grupo de alta mobilidade sérica box 1 eram maiores em pacientes com PAC do que em controles saudáveis e estavam associados com a mortalidade. Além disso, Zhang et al.(9) identificaram o peptídeo natriurético cerebral tipo N-terminal pro-B como um preditor efetivo dos eventos adversos cardíacos em pacientes com PAC, o que foi positivamente correlacionado com a gravidade da doença.

O peptídeo de defesa do hospedeiro LL-37, um fragmento do precursor hCAP18 da proteína catelicidina, foi previamente identificado como um potente regulador da resposta inflamatória.(10) Além das propriedades anti-infecciosas, o LL-37 também regula a secreção e a liberação de várias citocinas inflamatórias pelas células imunes. Jiao et al.(11) mostraram que o LL-37 deteriorou a asma via ativação de eosinófilos interagindo com células brônquio-epiteliais.Ademais, LL-37 exibiu melhora da sobrevida de camundongos sépticos por meio da exibição de piroptose de macrófagos, produção de citocinas inflamatórias e crescimento bacteriano.(12) No entanto, a expressão e a significância clínica do LL-37 na patogênese da PAC ainda não são claras.

O NLRP3 tem um importante papel no processo inflamatório em várias doenças e diversos processos biológicos.(13) Estudos mostram que o NLRP3 se eleva em razão de inflamação induzida por lesão e, então, é ativado, podendo promover pneumonia.(14) No entanto, poucos estudos enfocam na significância clínica de NLRP3 sérico em pacientes com PAC. O presente estudo tem como objetivo investigar a expressão de LL-37 e NLRP3 em pacientes com PAC, buscando oferecer mais informações sobre essa doença e gerar novos alvos para o tratamento de PAC.

MÉTODOS

População do estudo

Este estudo prospectivo incluiu 76 pacientes com PAC e 50 controles saudáveis, entre janeiro de 2015 e dezembro de 2016, no Jining No.1 People's Hospital. A PAC foi diagnosticada com base em sintomas do trato respiratório inferior e confirmada com radiografia torácica em 24 horas a partir da internação. Os pacientes com pneumonia associada a cuidados de saúde e aqueles com doenças autoimunes foram excluídos. O índice de gravidade de pneumonia (PSI) foi utilizado para classificar os pacientes nas classes leve/moderada (PSI classe de risco I-III) ou grave (PSI classe de risco IV-V), conforme previamente descrito.(15) Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Jining No.1 People's Hospital. E todos os participantes assinaram um termo de consentimento.

Coleta de dados

A avaliação de base incluiu idade, sexo, tratamento antimicrobiano antes do estudo, sintomas clínicos, dados laboratoriais, escore de PSI e mortalidade durante 30 dias de acompanhamento.

Teste de laboratório

As amostras de sangue foram coletadas dentro de 24 horas a partir da internação e armazenadas a -70 °C. A contagem de glóbulos brancos (LEU) foi determinada pelo laboratório do hospital. O teste ELISA foi realizado com kits comerciais para quantificação da proteína C-reativa (CRP; Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands), NLRP3 (Shanghai Sunred Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China) e LL-37 (Hycult Biotechnology, Uden, The Netherlands), de acordo com o protocolo do fabricante.

Análise estatística

Variáveis contínuas foram apresentadas como média ± desvio-padrão, se normalmente distribuídas, ou como média, caso não normalmente distribuídas, e comparadas por meio do teste de Wilcoxon-Mann Whitney, enquanto as comparações entre os grupos de variáveis categóricas foram realizadas usando o teste do qui quadrado. A análise de coeficiente de correlação de Spearman foi realizada para determinar a relação entre os níveis séricos de NLRP3 e LL-37. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar a análise de sobrevida. A correlação entre CRP, NLRP3 e LL-37 sérico e mortalidade em 30 dias foi feita utilizando análise de regressão logística multivariada. Em todas as análises, o valor-p<0,05 foi considerado significativo. As análises estatísticas foram realizadas com o SPSS, versão 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

RESULTADOS


Características dos pacientes

Foram incluídos no estudo 76 pacientes com PAC, cujos dados demográficos e características clínicas estão ilustrados na Tabela 1. Não houve diferença significativa entre os pacientes com PAC leve/moderada e grave com relação à idade, ao sexo, ao tratamento antimicrobiano antes do estudo e aos sintomas clínicos. Pacientes com PAC grave exibiram níveis séricos mais elevados de PCR, leucócitos e NLRP3, níveis reduzidos de LL-37 e maior taxa de PSI IV-V e de mortalidade durante os 30 dias de acompanhamento quando comparados com aqueles que apresentaram PAC leve/moderada (p<0,05).
 



Análise de correlação dos níveis séricos de NLRP3 e LL-37

Foram comparados também os níveis séricos de NLRP3 e LL-37 entre pacientes com PAC e controles saudáveis. O teste ELISA indicou níveis séricos mais altos de NLRP3 e LL-37 em pacientes com PAC do que em controles saudáveis (p<0,05) (Figura 1A). A análise de correlação de Spearman revelou uma correlação negativa entre os níveis séricos de NLRP3 e LL-37 (p<0,05) (Figura 1B).
 



Relação entre NLRP3 e LL-37 e parâmetros clínicos

Para determinar a significância clínica de NLRP3 e LL-37, todos os pacientes foram classificados em grupos de NLRP3 e LL-37 alto/baixo, de acordo com valores médios ou medianos. Conforme a Tabela 2, os pacientes com níveis elevados de NLRP3 ou reduzidos de LL-37 apresentaram níveis mais altos de PCR, leucócitos e mortalidade durante os 30 dias de acompanhamento quando comparados com pacientes com níveis séricos mais baixos de NLRP3 e mais altos de LL-37 (p<0,05). Além disso, observou-se um maior número de pacientes das classes I-III (PSI≤90 pontos) e IV-V (PSI>90 pontos) entre os níveis elevados de NLRP3 e mais baixos de LL-37 quando comparados com pacientes com níveis mais baixos de NLRP3 ou mais elevados de LL-37 (p<0,05).
 



Associação entre NLRP3 e LL-37 e taxa de sobrevida em 30 dias e de mortalidade

Avaliou-se também a relevância prognóstica de NLRP3 e LL-37 sérico em pacientes com PAC. As curvas de sobrevida Kaplan-Meier revelaram que pacientes com níveis mais altos de NLRP3 ou LL-37 apresentaram taxa de sobrevida menor do que aqueles com níveis mais baixos de NLRP3 ou LL-37 (p<0,05) com base no teste de classificação de log (Figura 1C).

Em seguida, realizou-se a regressão logística multivariada de acordo com os resultados apresentados. Conforme a Tabela 3, os níveis elevados de NLRP3 e os níveis reduzidos de LL-37 foram intimamente associados com a mortalidade em 30 dias em pacientes com PAC (Tabela 4).
 

 




DISCUSSÃO

A PAC é uma doença infecciosa comum associada com significativa morbidade e maior taxa de mortalidade, impondo uma ameaça à saúde humana ao redor do mundo.(4,16,17) Nos dias atuais, o diagnóstico inicial de PAC inclui, principalmente, sintomas respiratórios e sinais gerais, o que pode não ser um reflexo preciso da condição. Embora lesões pulmonares invisíveis sejam precisamente localizadas com fluoroscopia, os métodos torácicos atualmente utilizados de tomografia e radiografia torácicas são radioativos e muito caros.(18) Existe, portanto, uma necessidade urgente da descoberta e validação de novos biomarcadores séricos para PAC.

A PCR é uma proteína de fase aguda produzida pelas células hepáticas, altamente envolvida em processos inflamatórios.(19) Os níveis séricos de PCR são geralmente baixos em pessoas saudáveis, mas o estímulo por estresse, tais como infecção e dano ao órgão ou tecido, pode desencadear um aumento significativo de PCR sérica, o que não é susceptível a antibióticos, má nutrição, glicocorticoides ou imunossupressores.(20) A PCR é o biomarcador mais utilizado no diagnóstico e no tratamento de PAC por causa de seu baixo custo e sua alta sensitividade à inflamação.(21,22) No presente estudo, os níveis de PCR estavam altamente expressos em pacientes com PAC grave quando comparados com pacientes com PAC leve/moderada.

O papel de NLRP3 no processo inflamatório, incluindo pneumonia, tem sido demonstrado por várias pesquisas. Van Lieshout et al.(23) mostraram que o inflamassoma NLRP3 prejudica a defesa do hospedeiro durante pneumonia letal em camundongos. Também foi encontrado que o staphylococcus aureus α-hemolisina pode mediar a virulência por meio da ativação do inflamassoma NLRP3 em camundongos com pneumonia.(24) No entanto, apesar desses estudos, poucas outras pesquisas demonstraram a significância clínica de NLRP3 em pacientes com PAC. Os resultados deste estudo revelam, pela primeira vez, que o NLRP3 sérico foi significativamente regulado em pacientes com PAC quando comparados com controles saudáveis, bem como em pacientes com PAC grave quando comparados aos pacientes com PAC leve/moderada. Investigações adicionais elucidaram que pacientes com níveis elevados de NLRP3 apresentaram níveis séricos mais elevados de PCR e mais baixos de LL-37, maior número de leucócitos e mortalidade em 30 dias.

O LL-37 é o único membro da família catelicidina que é clivada a partir de um polipeptídeo antimicrobiano catiônico de 18 kDa. Além da sua ampla atividade antimicrobiana, o LL-37 tem papel fundamental na modulação imune e na cicatrização de feridas, além de ser antitumoral.(25,26) Foi comprovado que o LL-37 é significativamente sub-regulado em crianças com pneumonia.(27) Hou et al.(28) também mostraram que o LL-37 pode inibir a inflamação induzida por LTA, bem como suprimir o desenvolvimento de pneumonia em camundongos. No entanto, ainda não é claro se os níveis séricos de LL-37 estavam associados com o prognóstico de pacientes com PAC. Observou-se que os níveis séricos de LL-37 em pacientes com PAC, especialmente com PAC grave, também foram significativamente sub-regulados, e pacientes com LL-37 mais baixos apresentaram uma menor taxa de sobrevida. O presente estudo também tem algumas limitações: a população do estudo é limitada e os mecanismos pelos quais NLRP3 e LL-37 afetam a PAC continuam desconhecidos. Todas essas limitações requerem mais estudos para confirmação.

Em conclusão, conduziu-se um estudo prospectivo para investigar a significância clínica de NLRP3 e LL-37 em pacientes com PAC. Os resultados mostraram que NLRP3 estava significativamente elevado, enquanto LL-37 estava significativamente sub-regulado em pacientes com PAC. Além disso, ambos foram correlacionados com o prognóstico dos pacientes com PAC. Este estudo oferece evidências clínicas adicionais e um entendimento mais profundo do papel de NLRP3 e LL-37 em PAC.
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