ABSTRACT

Objective: To determine the role of the IL8 rs4073 polymorphism in predicting the risk of central nervous system (CNS) toxicity in patients receiving standard pharmacological treatment for multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB). Methods: A cohort of 85 consenting MDR-TB patients receiving treatment with second-line antituberculosis drugs had their blood samples amplified for the IL8 (rs4073) gene and genotyped. All patients were clinically screened for evidence of treatment toxicity and categorized accordingly. Crude and adjusted associations were assessed. Results: The chief complaints fell into the following categories: CNS toxicity; gastrointestinal toxicity; skin toxicity; and eye and ear toxicities. Symptoms of gastrointestinal toxicity were reported by 59% of the patients, and symptoms of CNS toxicity were reported by 42.7%. With regard to the genotypes of IL8 (rs4073), the following were identified: AA, in 64 of the study participants; AT, in 7; and TT, in 11. A significant association was found between the dominant model of inheritance and CNS toxicity for the crude model (p = 0.024; OR = 3.57; 95% CI, 1.18-10.76) and the adjusted model (p = 0.031; OR = 3.92; 95% CI, 1.13-13.58). The AT+TT genotype of IL8 (rs4073) showed a 3.92 times increased risk of CNS toxicity when compared with the AA genotype. Conclusions: The AT+TT genotype has a tendency to be associated with an increased risk of adverse clinical features during MDR-TB treatment.

Keywords: Tuberculosis, multidrug-resistant; Immunity; Pharmacogenetics; Polymerase chain reaction; Risk.

RESUMO

Objetivo: Determinar o papel do polimorfismo rs4073 do gene IL8 na previsão do risco de toxicidade do sistema nervoso central (SNC) em pacientes em tratamento farmacológico padrão para tuberculose multirresistente (TBMR). Métodos: Amostras de sangue de uma coorte de 85 pacientes com TBMR que assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido e que estavam recebendo tratamento com medicamentos antituberculosos de segunda linha foram amplificadas para o gene IL8 (rs4073) e genotipadas. Todos os pacientes foram avaliados clinicamente quanto a evidências de toxicidade do tratamento e categorizados de acordo com os achados. Foram avaliadas as associações brutas e ajustadas. Resultados: As principais queixas enquadraram-se nas seguintes categorias: toxicidade do SNC; toxicidade gastrointestinal; toxicidade cutânea; e toxicidade ocular e ototoxicidade. Sintomas de toxicidade gastrointestinal foram relatados por 59% dos pacientes, e sintomas de toxicidade do SNC foram relatados por 42,7%. Foram identificados os seguintes genótipos de IL8 (rs4073): AA, em 64 dos participantes; AT, em 7; TT, em 11. Houve associação significativa entre o modelo dominante de herança e toxicidade do SNC no modelo bruto (p = 0,024; OR = 3,57; IC95%: 1,18-10,76) e no ajustado (p = 0,031; OR = 3,92; IC95%: 1,13-13,58). O genótipo AT+TT do gene IL8 (rs4073) apresentou risco 3,92 vezes maior de toxicidade do SNC que o genótipo AA. Conclusões: O genótipo AT+TT tende a se associar a um maior risco de características clínicas adversas durante o tratamento da TBMR.

Palavras-chave: Tuberculose resistente a múltiplos medicamentos; Imunidade; Farmacogenética; Reação em cadeia da polimerase; Risco.

INTRODUÇÃO
 
A doença tuberculosa é muito comum em países pobres com elevada população de indivíduos infectados pelo HIV e/ou subnutridos. A Nigéria é um dos países com maior carga de tuberculose, com prevalência de 830.000 casos.(1,2) Um programa deficiente de controle da infecção tuberculosa é caracterizado por taxas baixas (abaixo do esperado) de diagnóstico da doença e tratamento insuficiente ou inadequado da tuberculose diagnosticada, o que resulta em falha do tratamento,(1) que pode ser atribuída à má adesão ao tratamento ou à falta de medicamentos eficazes disponíveis nos sistemas nacionais de saúde.(3) A falha do tratamento é mais evidente em pacientes com diagnóstico de tuberculose multirresistente (TBMR). Aproximadamente 45% de todos os casos tratados não conseguem alcançar um desfecho positivo, e esse desfecho do tratamento tem um papel enorme na persistência da doença tuberculosa.(4) Outro fator muito importante que contribui para a má adesão ao tratamento e a falha do tratamento são as reações adversas a medicamentos (RAM) comumente associadas ao tratamento da tuberculose. É importante observar que existem muitas possíveis RAM, tais como hepatotoxicidade, cardiotoxicidade e nefrotoxicidade, que poderiam de fato ser detectadas por meio de testes incorporados a um protocolo holístico de manejo da tuberculose. Testes rotineiros de enzimas hepáticas, a avaliação de biomarcadores de função renal e a ecocardiografia podem ser incorporados ao protocolo de manejo da tuberculose de modo a permitir a detecção precoce. Um número considerável de pacientes expressa frustração com seus medicamentos antituberculosos e param de tomá-los bem antes de qualquer achado objetivo que sugira a presença de toxicidade.(5) Assim, um preditor precoce de RAM seria a identificação de sintomas clínicos que anunciem a manifestação de uma RAM devastadora.
 
A neurotoxicidade, que pode ser central ou periférica, manifesta-se inicialmente através de uma série de características clínicas muito variadas, incluindo dor de cabeça, visão turva, tremores, tontura, zumbido nos ouvidos e má coordenação.(6-9) Outras manifestações graves e altamente mórbidas de neurotoxicidade incluem convulsões, perda de visão, ataxia, psicose, mioclonia e delírio.
 
Aumento da transpiração, erupções cutâneas, pele seca e coceira são características iniciais comuns da toxicidade cutânea de medicamentos antituberculosos, ao passo que a síndrome de Stevens-Johnson pode levar à morte.(10) Medicamentos antituberculosos podem causar visão turva reversível e, em casos graves, deficiência visual permanente.(11,12)
 
Há uma diferença clara entre os pacientes quanto à ocorrência de RAM. Alguns dos fatores de risco de RAM são bem conhecidos, ao passo que outros ainda não foram identificados.(13) Além de estabelecer um diagnóstico preciso de tuberculose, identificar fatores de risco de diferenças individuais quanto a RAM em pacientes em tratamento para tuberculose é muito importante para evitar iatrogenia medicamentosa em pacientes suscetíveis.
 
Polimorfismos em genes metabolizadores de medicamentos, tais como NAT2, GSTM1, GSTT1 e CYP2E1, têm sido implicados na variabilidade consideravelmente complexa dos níveis de medicamentos antituberculosos e seus efeitos, incluindo RAM.(13,14) Sabe-se bem que fatores ambientais podem modificar os efeitos dessas variações farmacogenéticas no metabolismo dos medicamentos antituberculosos. (13) Vários estudos farmacogenéticos investigaram o papel de polimorfismos genéticos de citocinas pró-inflamatórias como TNF, IL-6 e IL-8 em desfechos do tratamento antituberculose de primeira linha, tais como RAM.(14-16) Também já está bem estabelecido que o genoma humano apresenta uma série de variantes genéticas comuns que estão em desequilíbrio de ligação e que são herdáveis, sendo herdadas em uníssono juntamente com todas as variantes genéticas ainda não identificadas responsáveis pelos fenótipos clínicos (doença/desfecho do tratamento — eficácia ou RAM).(17) Assim, existe a possibilidade de que os loci gênicos das enzimas metabolizadoras de medicamentos sabidamente associados a medicamentos antituberculosos estejam ligados aos loci gênicos de citocinas pró-inflamatórias. (17 19) O presente estudo foi motivado pela escassez de estudos farmacogenômicos nos quais se avaliem as reações adversas a medicamentos antituberculosos de segunda linha, que são mais tóxicos por natureza, especialmente no tocante à neurotoxicidade, que não é monitorada por testes sorológicos periódicos no manejo da tuberculose. Além disso, o quadro de ação global atual da OMS para a pesquisa da tuberculose incentiva a pesquisa e as inovações voltadas para os pacientes em nível nacional, especialmente em países de baixa e média renda.(3,18)
 
MÉTODOS
 
Local e desenho do estudo
 
O desenho do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Ministério da Saúde do Estado de Kano, na Nigéria (NHREC/17/03/2018). Foram recrutados pacientes com tuberculose que estavam recebendo tratamento para TBMR no hospital ou na comunidade na cidade de Kano, na Nigéria. O estudo avaliou as associações entre polimorfismos de nucleotídeo único e fenótipos clínicos de toxicidade após o tratamento da TBMR com antituberculosos de segunda linha. A toxicidade clínica foi avaliada por meio do Patient-Rated Inventory of Side Effects (Inventário de Efeitos Colaterais Avaliados pelo Paciente) e incluiu sintomas gastrointestinais como náusea, vômito, constipação, diarreia, dor abdominal e perda de apetite, e sintomas do sistema nervoso central (SNC) como tontura, sonolência, dor de cabeça, má coordenação, inquietação e tremores.
 
Foi incluída neste estudo uma coorte de 85 pacientes que haviam recebido diagnóstico de TBMR e que estavam em tratamento para a doença. O esquema terapêutico para TBMR em nossa clínica incluiu levofloxacina, bedaquilina, etionamida, cicloserina, delamanida, pirazinamida, meropenem, linezolida e moxifloxacina. Os pacientes receberam as doses recomendadas pela OMS, sempre de acordo com o peso e/ou IMC.(20) Todos os pacientes foram diagnosticados em um centro de tuberculose por um médico treinado, que aplicou os critérios diagnósticos recomendados pela OMS. A definição de TBMR foi um resultado positivo no ensaio Xpert MTB/RIF (Cepheid, Sunnyvale, CA, EUA). Os critérios de inclusão foram os seguintes: evidências laboratoriais e/ou genéticas de TBMR no início da terapia; evidências de adesão ideal e conclusão do tratamento com medicamentos antituberculosos de segunda linha; não apresentar imunodeficiência ou outras doenças; e estar na faixa etária de 18 a 80 anos. Os critérios de exclusão foram os seguintes: estar muito doente e não ser capaz de assinar o termo de consentimento livre e esclarecido; não apresentar nenhuma evidência documentada de diagnóstico de TBMR; estar recebendo tratamento com medicamentos antituberculosos de primeira linha; não apresentar nenhuma evidência documentada de adesão ao tratamento; estar grávida; ter hepatite; e ter optado por não assinar o termo de consentimento livre e esclarecido.
 
Após o término do tratamento, foram coletados dos participantes que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido 5 mL de sangue venoso periférico por meio de uma seringa de 5 mL equipada com uma agulha de 18 G de calibre e de tamanho apropriado. O sangue foi anticoagulado com EDTA a 0,5% (pH = 8,0) em um tubo de EDTA. O DNA genômico foi extraído por meio de um kit de extração de DNA genômico de sangue total (QIAGEN, Hilden, Alemanha) em conformidade com as instruções do fabricante, com uma quantidade apropriada de etanol para biologia molecular (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, EUA), sendo armazenado a −20°C para uso posterior.
 
Os genótipos de IL8 (rs4073) foram amplificados por meio do iniciador direto (forward primer) apropriado: 5′-ATCTTGTTCTAACACCTGCCACTC-3′ e do iniciador reverso (reverse primer) 5′-TAAAATACTGAAGCTCCACAATTTGG-3′ na mistura de reação. A mistura de reação foi preparada para um volume total de 25 µL contendo 12,5 µL de DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), 5 µL de DNA molde, 1 µL de upstream primer, 1 µL de downstream primer e 5,5 μL de água livre de RNase. As condições de ciclagem da PCR consistiram em uma etapa inicial de desnaturação a 94°C durante 5 min, seguida de 35 ciclos a 94°C durante 50 s, 61°C durante 60 s e 72°C durante 55 s, seguidos de uma etapa final de extensão a 72°C durante 5 min. O produto da PCR foi digerido com a enzima de restrição MfeI (Thermo Fisher Scientific) a 37°C durante 2 h e desativado a 80°C durante 20 min. O produto digerido da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 2%, em solução tampão Tris-acetato-EDTA ultrapura, visualizado sob iluminação ultravioleta, escaneado e fotografado.(21)
 
Cálculo do tamanho da amostra
 
Para o presente estudo, o tamanho da amostra foi calculado para obter um poder de 80% e um nível de significância de 5% para identificar uma diferença de OR de pelo menos duas vezes (OR = 2) na distribuição de genótipos para TBMR, cuja prevalência é de 32% na Nigéria.(22) As estimativas da literatura foram inseridas na fórmula de Schlesselman para o cálculo do tamanho da amostra:
 
M = m/Pe
 
em que m = (((Z1-a/2/2 + Z1-b) (P*(1-P*))1/2)2 / (P*-0.5)2; P* = OR/(1 + OR); Pe (probabilidade de exposição-par discordante) = (p1(1-p0) + p0(1-p1); p1(proporção de indivíduos expostos desenvolvendo caso) = p0 (OR)/1 + p0 (OR-1); e p0 = taxa de exposição entre controles em populações.
 
O tamanho amostral estimado para casos e controles foi de 30 cada, num total de 60 (m = 14,495; Pe = 0,118; P* = 0,667; p1 = 0,485; M = 30).
 
RESULTADOS
 
As características sociodemográficas dos participantes do estudo estão descritas na Tabela 1. Os participantes do estudo eram em sua maioria pobres (n = 74; 87,06%), embora ganhassem alguma renda através do trabalho (n = 77; 90,59%). A média de idade dos participantes foi de 31,88 ± 11,51 anos. A maioria pertencia ao grupo étnico hauçá, era muçulmana (islamismo), estava empregada e era oriunda de famílias de baixa renda (Tabela 1).

 

 
No tocante às características clínicas dos participantes do estudo, mais de 22,5% apresentavam história de tuberculose/TBMR, história de tratamento de tuberculose e/ou história familiar de tuberculose. Como se pode observar na Tabela 2, os participantes do estudo relataram os seguintes sintomas relacionados ao tratamento da TBMR: sintomas gastrointestinais, sintomas do sono, sintomas do SNC, sintomas cutâneos, sintomas cardiovasculares e sintomas do trato urinário. Os sintomas do SNC incluíram os seguintes: dor de cabeça (em 9,8%), tremores (em 14,6%), má coordenação (em 2,4%) e tontura (em 11%). Os sintomas gastrointestinais incluíram os seguintes: vômito/náusea (em 30,1%), diarreia (em 7,2%) e constipação (em 2,4%). Visão turva e zumbido nos ouvidos também foram relatados (por 7,2% e 13,3%, respectivamente).
 

 
No tocante aos genótipos de IL8 (rs4073), foram identificados os seguintes: AA (homozigoto selvagem), em 64 dos participantes do estudo; AT (heterozigoto selvagem), em 7; e TT (homozigoto), em 11 (Tabela 3). Nenhum dos genótipos de IL8 (rs4073) apresentou relação significativa com fenótipos de RAM, à exceção do fenótipo de toxicidade do SNC. A Tabela 3 mostra a distribuição dos genótipos de IL8 (rs4073), de acordo com o modelo de herança e o fenótipo de toxicidade do SNC.
 

 
Houve associação significativa entre o modelo dominante de herança e a variável dependente binária (presença ou ausência de RAM envolvendo o SNC) no modelo bruto (p = 0,024; OR = 3,57; IC95%: 1,18-10,76) e no ajustado (p = 0,031; OR = 3,92; IC95%: 1,13-13,58; Tabela 3). O genótipo AT+TT do gene IL8 (rs4073) apresentou risco 3,92 vezes maior de toxicidade do SNC que o genótipo AA.
 
DISCUSSÃO
 
Em nossa amostra de pacientes com TBMR, havia mais homens que mulheres (n = 58 vs. n = 28), e o número de participantes casados e não casados foi o mesmo (n = 41 para ambos). As características religiosas e étnicas dos participantes do estudo foram consistentes com as predominantemente observadas na população do estado de Kano, na Nigéria. O predomínio de indivíduos de baixa renda e escolaridade fundamental em nossa amostra de pacientes com TBMR foi semelhante ao que se observa em outras áreas onde a tuberculose é endêmica. Houve associação significativa entre o modelo dominante de herança dos genótipos de IL8 (rs4073) e a toxicidade do SNC. A presença do alelo T (no genótipo AT+TT) aumentou significativamente o risco de toxicidade do SNC (em 3,92 vezes).
 
Pelo que sabemos, a relação observada no presente estudo entre genótipos de IL8 (rs4073) e toxicidade do SNC é um achado novo. Embora estudos anteriores tenham avaliado a relação entre IL8 (rs4073) e fenótipos da doença tuberculosa, nenhum estudo avaliou a relação entre IL8 (rs4073) e fenótipos de RAM relacionadas ao tratamento. Há relatos de que existe relação entre IL8 (rs4073) e outras doenças, incluindo câncer de mama e doença autoimune da tireoide.(23,24) Nos estudos supracitados,(23,24) o risco de câncer de mama ou doença autoimune da tireoide foi maior com o genótipo TT do que com o genótipo AA. Em outro estudo,(25) o polimorfismo rs4073 do gene IL8 foi avaliado em seus modelos dominante, recessivo e alélico, e apresentou relação com risco de doença tuberculosa pulmonar. Assim, o papel do genótipo TT é semelhante em nosso estudo e outros estudos da literatura no tocante a sua tendência de associação a um maior risco de características clínicas adversas, não obstante a diferença quanto às características clínicas avaliadas; os estudos supracitados avaliaram câncer de mama, tuberculose e doença autoimune da tireoide, ao passo que nosso estudo avaliou sintomas de toxicidade do SNC. Ainda não se elucidou o mecanismo exato pelo qual esse polimorfismo influencia o surgimento de doenças como câncer de mama, tuberculose e doença autoimune da tireoide. Compreensivelmente, também ainda não se estabeleceu o papel dos genótipos na toxicidade dos medicamentos antituberculosos de segunda linha. No entanto, o mecanismo pelo qual as citocinas contribuem para a toxicidade em qualquer órgão pode ser semelhante aos mecanismos de hepatotoxicidade. A hepatotoxicidade é o mais estudado mecanismo de toxicidade de antituberculosos, e os mecanismos identificados de hepatotoxicidade podem ser semelhantes aos de outras toxicidades. Ela provém diretamente dos metabólitos dos medicamentos ou indiretamente da mediação imunológica.(26) Assim, o delicado equilíbrio entre citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias desempenha um papel vital na progressão da lesão tecidual imunomediada. Os mecanismos anti-inflamatórios no fígado suprimem a ação e produção de fatores pró-inflamatórios como TNF-α, IFN-c, IL-1 e IL-8, limitando assim a progressão da hepatotoxicidade.(27) Na mesma linha, o papel anti-inflamatório da IL-8, que é abundantemente secretada por neutrófilos, células apresentadoras de antígenos como oligodendrócitos, e células de Schwann, poderia supostamente estar subjacente a seu papel na toxicidade do SNC e outros tecidos. Além disso, as ações da região promotora proximal do gene IL8 (rs4073) que modula o nível transcricional de suas proteínas codificadas por (quatro) éxons intercalados a três regiões de íntrons talvez possam explicar seu papel na variabilidade interindividual atribuível a seus diferentes genótipos no sítio polimórfico.(28) Essa explicação putativa parece muito plausível e está de acordo com a conclusão do presente estudo, isto é, a de que o genótipo AT+TT aumenta o risco de toxicidade do SNC. Não obstante, uma avaliação mecanicista completa deve ser realizada para fins de validação.
 
Uma das limitações do presente estudo foi o fato de que não avaliamos a associação entre os sintomas de toxicidade do SNC e os genótipos das diferentes enzimas metabolizadoras de medicamentos. Estudos futuros nos quais se avalie a relação de genótipos de enzimas metabolizadoras de medicamentos e IL8 (rs4073) com sintomas de toxicidade poderiam identificar a presença ou ausência de desequilíbrio de ligação nesses loci gênicos.
 
Em suma, este estudo demonstrou que existe relação entre o polimorfismo rs4073 do gene IL8 e sintomas de toxicidade do SNC em pacientes com TBMR em tratamento com medicamentos de segunda linha padrão. Essa relação precisa ser confirmada por estudos controlados.
 
AGRADECIMENTOS
 
Os autores gostariam de agradecer ao Ministério da Saúde do Estado de Kano e ao Conselho de Administração dos Hospitais do Estado de Kano a permissão para realizar este estudo. Gostaríamos de agradecer também às seguintes pessoas sua contribuição para este estudo: Dr. Imam Wada Bello, Enfermeira-Chefe Hajia Zulai Sulaiman Tukur, Mal Aminu Tukur, Dr. Ibrahim Aliyu Umar e Aishat Ahmad Umar do Centro de Doenças Infecciosas da Bayero University Kano; e Dr. Ibrahim Sulaiman, Dr. Muktar Muhammad e Mahmud Muhammad Rabiu. Finalmente, gostaríamos de agradecer à Diretoria de Inovação e Parceria em Pesquisa a coordenação do financiamento.
 
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES
 
IBM, IAA, MAG, IAU e JS elaboraram o conceito do estudo. AUA, U-AMM, MM, OJ, I-MK, IBM e IAU participaram da coleta de dados. AUA, U-AMM, I-MK e IBM participaram da genotipagem. AUA, U-AMM, I-MK, IBM, JS e MAG participaram da análise dos dados. Todos os autores revisaram o manuscrito.
 
CONFLITOS DE INTERESSE
 
Nenhum declarado.
 
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